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成功的IHC/ICC實驗操作指南(八)

實驗的每一小步,都是決定結果的一大步。本期將為大家講解抗原修復的重要性,喜歡的話就繼續往下看吧!

盡管固定對于組織形態的保留是必不可少的,但這一過程對IHC/ICC檢測也有不良影響。固定可能改變蛋白的生化特性,如目的表位被掩蓋不再與一抗結合。表位的掩蓋可能是由表位內氨基酸的交聯、表位或附近位點與無關肽段的交聯、表位構象的改變或抗原靜電荷的改變引起的。抗原修復指的是任何可以逆轉表位掩蓋和恢復表位-抗體結合的技術。

抗原修復技術

抗原修復的需要取決于多個變量,包括但不限于,目的抗原、所使用的抗體、組織類型,以及固定方法和持續時間。多克隆抗體能識別多個表位,因此即使不進行抗原修復,它們也比單克隆抗體更有可能檢測到特定抗原。

目前有多種技術可恢復表位的免疫反應性。簡單的方法有改變抗體稀釋液的ρH或陽離子濃度,這可能影響抗體與表位的親和力。對于部分掩蓋的表位,在開始抗原修復之前可以先試試改變一抗的孵育條件。不過,這一步也需要抗體濃度、孵育時間和溫度的進一步優化。在討論抗體修復方法時,技術通常分為兩大類,蛋白酶誘導的表位修復(PIER)和熱誘導的表位修復(HIER)。一旦優化好,抗原修復的影響可以是明顯的。

蛋白酶誘導的表位修復(PIER)

在PIER方法中,蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢復抗體與表位的結合。人們認為作用機制是切割了可能遮蓋表位的肽段。PIER的缺點在于恢復免疫反應性的成功率低,且有可能破壞組織形態和目的抗原。

熱誘導的表位修復(HIER)

HIER被認為能逆轉一些交聯,并實現表位二級或三級結構的重建。實驗方案必須針對每種組織、固定方法和待研究抗原進行優化。總的來說,HIER的成功率比PIER要高得多。

HIER可利用微波爐、高壓鍋、蒸屜、高壓滅菌鍋或水浴開展。在HIER實驗中,微波爐是越來越流行的設備。這些方案大多加熱5分鐘,然后更換緩沖液。對于所有HIER方法,在開始IHC/ICC孵育之前必須讓玻片冷卻。HIER對時間、溫度、緩沖液和pH特別敏感,最佳方法必須根據經驗確定。

優化和局限性

抗原修復可能需要加強樣品與玻片或蓋玻片的附著。此外,此技術對于冰凍組織切片和醇固定切片通常過于劇烈。對于每種設備,時間、溫度和pH必須經過優化(如92-95°C水浴要5-10分鐘,而120°C高壓鍋要1-5分鐘)。為了優化抗原修復,必須開展預實驗,使用時間、溫度和pH的各種組合。在使用抗原修復方法時,應始終考慮到假陽性的可能性。實驗應當包含對照,以證明特異的抗體結合,因為染色常受到實驗中多個變量的影響。

R&D Systems提供了一些試劑,可改善組織抗原檢測,并增強免疫反應性。在初次優化時,研究人員可比較經中性pH7.0通用抗體修復液(貨號CTS015)處理的樣品和未經過抗原修復的同一組織樣品。之后可能需要使用酸性或堿性的抗原修復液,這取決于組織。在R&D Systems,我們發現堿性抗原修復液(貨號CTS013)的處理通常很成功。我們也提供酸性(貨號CTS014)以及試用裝(貨號CTS016)的抗原修復液。與中性溶液相比,酸性和堿性抗原修復液更可能影響組織形態。

以上文字和圖片來源于Bio-techne。

 

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